Media Biakan Pada Mikrobiologi Peternakan

 Media Biakan Pada Mikrobiologi Peternakan

Sterilisasi Dan Pembuatan Media Satu tahapan penting yang harus dilakukan dan merupakan aturan standar selama melaksanakan praktikum atau kerja mikrobiologi adalah sterilisasi. Sterilisasi adalah suatu proses pembebasan suatu bahan atau alat dari semua bentuk organisme hidup. Sterilisasi dapat dilakukan tergantung dari bahan atau alat yang akan disteril. Sterilisasi dapat dilakukan dengan berbagai cara yaitu: Macam-macam Sterilisasi.

Sterilisasi dapat dilakukan dengan 3 cara, yaitu cara mekanik, cara fisik, dan cara kimiawi. 1. Sterilisasi cara mekanik (filtrasi) menggunakan suatu saringan yang berpori sangat kecil (0.22 mikron atau 0.45 mikron) sehingga mikroba tertahan pada saringan tersebut. Proses ini ditujukan untuk sterilisasi bahan yang peka panas, misalnya larutan enzim dan antibiotik.Sterilisasi secara fisik dapat dilakukan dengan pemanasan danpenyinaran. a. Pemanasan  Pemijaran (dengan api langsung): membakar alat pada api secara langsung, contoh alat: jarum inokulum (jarum ose), pinset, batang L.  Panas kering: sterilisasi dengan oven kira-kira 60-180oC. Sterilisasi panas kering cocok untuk alat yang terbuat dari kaca, misalnya erlenmeyer, tabung reaksi, cawan.  Uap air panas: konsep ini mirip dengan mengukus. Bahan yang mengandung air lebih tepat menggunakan metode ini supaya tidak terjadi dehidrasi.  Uap air panas bertekanan: menggunakan autoklaf. b. Penyinaran dengan Ultra Violet (UV) Sinar UV juga dapat digunakan untuk proses sterilisasi, misalnya untuk membunuh mikroba yang menempel pada permukaan interior Safety Cabinet dengan disinari lampu UV. 2. Sterilisasi secara kimiawi biasanya menggunakan senyawa desinfektan, antara lain alkohol. 

Media Pertumbuhan Mikroba Medium adalah suatu bahan yang terdiri atas campuran nutrisi yang dipakai untuk menumbuhkan mikroba. Selain untuk pembuatan mikroba, medium dapat pula digunakan untuk melakukan isolasi, memperbanyak, pengujian sifat- sifat fisiologi dan perhitungan mikroba. Dalam proses pembuatan media harus disterilisasi dan menerapkan metode aseptis untuk menghindari kontaminasi pada media. 8 Media adalah suatu suubstrat untuk menumbuhkan bakteri yang menjadi padat dan tetap tembus pandang pada suhu inkubasi. Sedangkan medium adalah suatu bahan nutrisi tempat menumbuhkan bakteri di laboratorium. 

Macam-macam Media Pertumbuhan Media pertumbuhan mikroba dapat dibedakan berdasarkan sifat fisiknya, komposisi media dan tujuan kegunaannya. Berdasarkan sifat fisiknya media pertumbuhan dapat dibedakan atas 3 yaitu: a) Media padat: media yang komposisinya agar 15 % sehingga setelah dingin media menjadi padat. b) Media setengah padat : media yang komposisi agarnya 0,3-0,4% sehingga menjadi sedikit kenyal, tidak padat, tidak begitu cair. Media semi solid dibuat dengan tujuan: 1) supaya pertumbuhan mikroba dapat menyebar ke seluruh media, tetapi tidak mengalami percampuran sempurna jika tergoyang. Misalnya, bakteri yang tumbuh pada media Nitrogen free Bromthymol Blue (NfB) semisolid akan membentuk cincin hijau kebiruan di bawah permukaan media jika media ini cair maka cincin ini dapat dengan mudah hancur. 2) untuk mencegah/menekan difusi oksigen, misalnya pada media Nitrate Broth, kondisi anaerob atau sedikit oksigen meningkatkan metabolisme nitrat, tetapi bakteri ini juga diharuskan tumbuh merata di seluruh media c) Media cair: media yang tidak mengandung agar contohnya nutrient broth (NB), lactose broth (LB) 

Berdasarkan komposisinya medium pertumbuhan dikelompokkan dalam: a) Medium sintesis yaitu; media yang komposisi zat kimianya (glukosa, agar, dll) diketahui secara jelas dan pasti; misalnya Glucose Agar, Mac Conkey Agar. b) Medium semi sintesis yaitu; media yang sebagian komposisinya diketahui secara pasti contoh PDA yang terdiri dari agar, dekstrosa, dan ekstra kentang (ekstra kentang tidak diketahui apa komposisi senyawanya). c) Medium non sintesis yaitu; medium yang dibuat langsung dari bahan dasarnya dengan komposisi yang tidak dapat diketahui secara pasti. Contoh: tomato juice agar, Brain Heart Infusion Agar, Pancreatic Extract. 

Berdasarkan tujuan penggunaannya: a) Media untuk isolasi; umumnya media yang mengandung semua unsur essensial untuk pertumbuhan; contoh: NA Medium Selektif; medium yang selain mengandung nutrisi juga mengandung senyawa tertentu yang berfungsi untuk menghambat atau menekan pertumbuhan mikroba bukan sasaran. Contoh: media Luria Bertani yang ditambah Amphisilin untuk merangsang E. coli resisten antibiotik dan menghambat kontaminan yang peka Amphisilin. Salt broth b) yang ditambah NaCl 4% untuk membunuh Streptococcus agalactiae yang toleran terhadap garam. c) Medium diperkaya: medium yang mengandung bahan dasar untuk pertumbuhan mikrobia tetapi ditambah komponen komplek lainnya seperti serum, kuning telur atau lainnya. d) Medium untuk peremajaan kultur. e) Medium untuk karakterisasi bakteri digunakan untuk mengetahui kemampuan spesifik suatu mikroba. Kadang-kadang indikator ditambahkan untuk menunjukkan adanya perubahan kimia. Contohnya, Nitrate Broth, Lactose Broth, Arginine Agar. f) Media diferensial bertujuan untuk mengidentifikasi mikroba dari campurannya berdasarkan karakter spesifik yang ditunjukkan pada media diferensial, misalnya Triple Sugar Iron Agar (TSIA) yang mampu memilih Enterobacteria berdasarkan bentuk, warna, ukuran koloni, dan perubahan warna media di sekeliling koloni.

Syarat – syarat medium supaya mikroba dapat tumbuh biak:  Medium harus mengandung semua nutrisi yang mudah digunakan oleh mikroba  Medium harus mempunyai tekanan osmosis, tegangan muka, pH  Medium tidak mengandung zat-zat penghambat  Medium harus steril 

Teknik Isolasi Dan Pembenihan Mikroorganisme 

Pada lingkungan alami mikroba tidak hidup sendiri melainkan bersama-sama baik itu dari spesies yang berbeda maupun dari jenis makhluk hidup yang bukan kelompok mikroba. Jenis mikroba tersebut dapat diketahui, dengan melakukan pemisahan dari makhluk hidup lainnya, yang dikenal dengan istilah isolasi. Adapun cara yang umum digunakan untuk isolasi adalah cara suspensi. Cara suspensi maksudnya adalah sampel mikroba yang telah diambil, dibuat suspensi baru kemudian suspensi itu ditumbuhkan pada media agar tertentu. Cara ini bertujuan agar pertumbuhan mikroba dari sampel pada saat ditumbuhkan pada media agar, tidak terlalu menumpuk (crowded). Isolat murni dapat diperoleh, bila dilakukan isolasi secara bertahap menggunakan media yang tepat, misal: Nutrient Agar untuk bakteri dan Potato Dextrose Agar untuk mengisolasi khamir dan kapang. Setiap pertumbuhan koloni yang menunjukkan kenampakan berbeda harus ditumbuhkan ulang pada media agar baru dan dilakukan isolasi kembali (reisolasi). Isolasi adalah proses atau kegiatan memisahkan mikroba dari campurannya sehingga didapatkan kultur murni.

Teknik Pengambilan Sampel Sebelum melakukan isolasi terlebih dahulu dilakukan pengambilan sampel. Botol atau alat gelas lain yang digunakan untuk mengambil sampel hendaknya disterilkan lebih dahulu. 9 a. Sampel tanah Jika mikroba yang diinginkan kemungkinan berada di dalam tanah maka cara pengambilannya disesuaikan dengan tujuan dan kebutuhan. Misalnya, apabila yang diinginkan mikroba rhizosfer maka sampel diambil dari sekitar perakaran dekat permukaan hingga ujung perakaran. b. Sampel Air Pengambilan sampel air bergantung kepada keadaan air itu sendiri. Jika berasal dari air sungai yang mengalir maka botol dicelupkan miring dengan bibir botol melawan arus air. Apabila pengambilan sampel dilakukan pada air yang tenang, botol dapat dicelupkan dengan tali, jika ingin mengambil sampel dari air kran maka sebelumnya kran dialirkan dulu beberapa saat dan mulut kran dibakar. 

Isolasi Dengan Cara Pengenceran a. Preparasi Suspensi Sampel yang telah diambil kemudian disuspensikan dalam akuades steril. Tujuan dari teknik ini pada prinsipnya adalah melarutkan atau melepaskan mikroba dari substratnya ke dalam air sehingga lebih mudah penanganannya. b. Teknik Pengenceran Bertingkat Tujuan dari pengenceran bertingkat, yaitu memperkecil atau mengurangi jumlah mikroba yang tersuspensi dalam cairan. Penentuan besarnya atau banyaknya tingkat pengenceran tergantung kepada perkiraan jumlah mikroba dalam sampel. Digunakan perbandingan 1 : 9 untuk sampel dan pengenceran pertama, selanjutnya sehingga pengenceran berikutnya mengandung 1/10 sel mikroba dari pengenceran sebelumnya.

c. Teknik Penanaman 1. Teknik penanaman dari suspensi Teknik penanaman ini merupakan lanjutan dari pengenceran bertingkat. Pengambilan suspensi dapat diambil dari pengenceran mana saja, tetapi biasanya untuk tujuan isolasi (mendapatkan koloni tunggal) diambil beberapa tabung pengenceran terakhir.  Spread Plate (agar tabur ulas) Spread plate adalah teknik menanam dengan menyebarkan suspensi bakteri di permukaan agar diperoleh kultur murni.  Pour Plate (agar tuang) Teknik ini menggunakan agar yang belum padat (> 45oC) untuk dituang bersama suspensi bakteri ke dalam cawan petri kemudian dihomogenkan dan dibiarkan memadat. Hal ini akan menyebarkan sel-sel bakteri tidak hanya pada permukaan agar saja melainkan sel terendam agar (di dalam agar) sehingga terdapat sel yang tumbuh di permukaan agar yang kaya O2 dan ada yang tumbuh di dalam agar yang tidak begitu banyak mengandung oksigen. 2. Teknik penanaman dengan goresan (streak) Bertujuan untuk mengisolasi mikroba dari campurannya atau meremajakan kultur ke dalam media baru. a) Goresan Sinambung b) Goresan T. c) Goresan Kuadran (streak quadrant).

Pewarnaan Mikroba Prinsip dasar dari pewarnaan ini adalah ikatan ion antara komponen seluler dari bakteri dengan senyawa aktif dari pewarna yang disebut kromogen. Terjadi ikatan ion karena adanya muatan listrik baik pada komponen seluler maupun pada pewarna. Berdasarkan adanya muatan ini maka dapat dibedakan pewarna asam dan pewarna basa. Pewarna asam dapat terjadi bila senyawa pewarna bermuatan negatif. Dalam kondisi pH mendekati netral dinding sel bakteri cenderung bermuatan negatif, sehingga pewarna asam yang bermuatan negatif akan ditolak oleh dinding sel, maka sel tidak berwarna.

Pewarna asam ini disebut juga pewarna negatif. Contoh pewarna asam misalnya: tinta cina, larutan nigrosin, asam pikrat, eosin dan lain-lain. Pewarna basa bisa terjadi bila senyawa pewarna bermuatan positif. Sehingga akan diikat oleh dinding sel bakteri jadi terwarna dan terlihat. Contoh dari pewarna basa misalnya : metilen blue, Kristal violet, safranin, dan lain-lain. Teknik pewarna asam basa ini hanya menggunakan satu jenis senyawa pewarna, teknik ini disebut pewarna sederhana. Pewarna sederhana ini diperlukan untuk mengamati morfologi, baik bentuk maupun susuna sel. Teknik pewarna yang lain adalah pewarna diferensial, yang menggunakan senyawa lebih dari satu jenis. Diperlukan untuk mengelompokkan bakteri misalnya, bakteri Gram positif atau bakteri tahan asam dan tidak tahan asam, juga diperlukan untuk mengamati struktur bakteri seperti flagella, kapsula, spora dan nukleus.

Teknik pewarnaan bukan pekerjaan yang sulit tapi perlu ketelitian dan kecermatan bekerja serta mengikuti aturan yang berlaku yakni sbb: 1. Mempersiapkan kaca obyek. Kaca obyek ini harus bersih dan bebas lemak untuk membuat apusan bakteri yang akan diwarnai. 2. Mempersiapkan apusan. Apusan yang baik adalah yang tipis dan kering, terlihat seperti lapisan yang tipis. Apusan ini dapat berasal dari cairan atau padat.  Biakan cair. Suspensi sel sebanyak satu atau dua macam jarum inokulasi diletakkan pada kaca obyek, lalu diapuskan pada kaca obyek selebar 1-2 cm. biarkan mongering di udara atau di atas api kecil dengan jarak 25 cm.  Biakan padat, bakteri yang dikultur pada medium padat tidak dapat langsung dibuat apusan seperti dari biakan cair, tapi harus diencerkan dulu. Letakkan setetes air pada kaca obyek, lalu dengan jarum inokulasi ambil bakteri dari biakan padat, letakkan pada tetesan air dan apuskan. Biarkan mongering di udara.  Fiksasi dengan pemanasan. Apusan bakteri pada kaca obyek bila tidak diletakkan secara kuat, dapat terhapus pada waktu proses pewarnaan lebih 13 lanjut. Proses peletakan apusan pada kaca obyek dapat dilakukan diantaranya dengan cara memanaskan di atas api. Pewarnaan Spora Spora pada bakteri merupakan struktur yang tahan terhadap panas dan bahan kimia. Spora dibentuk oleh bakteri tertentu untuk mengatasi lingkungan yang tidak menguntungkan bagi bakteri. Contoh bakteri yang membentuk spora adalah Bacillus, Clostridium, Thermactinomyces dan sporocasina. Spora terbentuk di dalam sel sehingga disebut sebagai endospore. Dalam sel bakteri hanya terdapat satu spora.